欧美日韩亚洲国产精品,91精品久久人人妻人人做人人爱,99精品国产综合久久精品自在,亚洲国产欧美目韩成人综合,site:jiangsuyinhang.com,亚洲最新无码AV在线,韩国激情无码av一区二区

歡迎光臨! �(dāng)前位置: 首頁 > 詳細�(nèi)�

【產(chǎn)品編號�2793949

【英文名稱�5fC fC-CET Kit

【中文名稱�全基因組5-醛基胞嘧啶檢測試劑盒

【產(chǎn)品內(nèi)容�

�(chǎn)品組�

含量

溶液P1Buffer P1

2.4 mL

AI溶液

24

DBCO20uM

24ul

Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1

480ul

溶液BDBuffer BD

480ul

溶液BWBuffer BW

10mL

溶液TWBuffer TW

5mL

模式序列

24ul

5fC模式序列引物�10uM

24ul

Control模式序列引物�10uM

24ul

注:溶液P1:疊氮茚二酮反應(yīng)��AI:疊氮茚二酮

【保存條件�AI溶液�DBCO、模式序列�5fC模式序列引物�Control模式序列引物置于

-20 °C,可保存12個月�

溶液P1Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1、溶�BD、溶�BW和溶�TW置于4 °C,可保存12個月�

【產(chǎn)品概述�

5-甲基胞嘧啶修飾(5mC)是真核細胞基因組中最為重要的表觀遺傳修飾之一�5mC可以�TET家族酶的作用下逐步氧化生成5-羥甲基胞嘧啶�5hmC��5-醛基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC�;對于上述幾種新�DNA修飾的功能研究是目前核酸表觀遺傳�(xué)的一個研究熱��

百靈威推出新�5fC檢測試劑�,它主要用于5-醛基胞嘧啶(5-formylcytosine, 5fC)的全基因組單堿基分辨率測序;也可應(yīng)用于5fC在生物發(fā)育和疾病�(fā)生發(fā)展過程的生物�(xué)功能研究�

【流程概述�

5fC fC-CET Kit 原理�

 【自備材料�

•Oligo Clean & Concentrator (ZYMO, #D4060)

NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB,#E7645)

NEBNext Singleplex or Multiplex Oligos for Illumina (NEB #E7350, #E7335, #E7500, #E7600, #E6609, #E7710, or #E7730)

NEBNext® End Repair Module (NEB E6050)

AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881)

SYBR Premix Ex TaqTM II (Takara, Cat. # RR82LR)

MightyAmp® DNA Polymerase Ver.3 (TaKaRa, Cat.#R076A)

Bio-Spin® P-30 Gel Columns, Tris Buffer (BioRad#7326231)

二硫蘇糖�DTT(0.05mM)

無水乙醇

滅菌超純�

低吸�EP�PCR

磁力�

PCR熱循�(huán)儀

旋轉(zhuǎn)混勻儀(Rotating Mixer)

Thermo-mixer (Eppendorf)

【注意事項�

A.    磁珠操作注意事項�

�(yīng)將磁珠孵育至室溫后再使用

每次吸取磁珠前都�(yīng)將其充分混勻

DNA樣品加入磁珠后應(yīng)將其充分混勻

所有磁珠操作都�(yīng)于室溫進行

移取上清操作�(yīng)在磁珠被徹底吸附后小心進行

磁珠在洗脫之前應(yīng)充分干燥,避免乙醇殘留影響后續(xù)實驗

B.    避免樣品交叉污染

吸取不同樣品時更換槍�

C. 請嚴(yán)格按照實驗步驟進行,修改實驗步驟會對富集造成影響

D. 酶的取放�(yīng)在冰上進行,為避免反復(fù)凍融或長期使用后活性下�,我們推薦您在首次使用后將剩余試劑小份分裝凍存�

【實驗步驟�

. 末端修復(fù)

1. 將片段化�DNA(平均長度約300bp�,按�NEBNext® End Repair Module(NEB E6050)說明書進行末端修復(fù)�

2. 按照AMPure XP Beads(Beckman Coulter, Inc. #A63881)說明書純�DNA�

3. 加入52 ul 超純水,洗脫,吸�50 ul至新EP管中,準(zhǔn)備下一步反�(yīng)�

注:純化�DNA純度要求�OD 260OD 280= 1.82.0

. AI介導(dǎo)�5fC�(biāo)�

1. 向上�50 ul洗脫液中加入50 ul溶液P1,充分混勻�

2. 全部�(zhuǎn)移至裝有AI溶液�EP管中,充分混勻,置于Thermo-mixer (Eppendorf)��37°C850rmp反應(yīng)24h�

3. 24h�,將EP管取出,12,000 rpm (~13,400×g) 離心2 min�

4. 將上清取出,�(zhuǎn)移至�EP管中�

注意:取上清�,若吸到沉淀,需重復(fù)步驟3�

5. 按照Oligo Clean & Concentrator (ZYMO, #D4060) 說明書純化上��

. 文庫�(gòu)�

1. 按照NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina說明�,將上述純化后的上清進行NEBNext End Prep. Adaptor Ligation操作�

2. 按照AMPure XP Beads(Beckman Coulter, Inc. #A63881)說明書純化上述產(chǎn)物,加入51 ul 超純水洗�,吸�49 ul至新EP管中,準(zhǔn)備下一步反�(yīng)�

四.化學(xué)反應(yīng)

1. 向上�49 ul洗脫液中加入1ul DBCO20mM),置于Thermo-mixer (Eppendorf)��37°C�850rmp反應(yīng)1h�

2. 1h�,按�Oligo Clean & Concentrator (ZYMO, #D4060)說明書純化上述溶��

注:�25μl洗脫緩沖液洗��

五.富集含有5fC的片�

1. Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1(以下簡�C1 beads)處理:

1)將Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1(以下簡�C1 beads)充分混�, 吸取10ul至新EP管中�

2)置于磁力架�,放�2.5 min,待溶液完全澄清�,棄去上��

3)加�1 mL溶液BW,將C1 beads完全重懸,置于旋�(zhuǎn)混勻儀(Rotating Mixer) 旋轉(zhuǎn)混勻1 min�

4)取下后短暫離心,置于磁力架�,放�2.5 min,待溶液完全澄清�,棄去上��

5)重�(fù)步驟3�4兩次�

6)加�20ul溶液BD,重�C1 beads待用�

2. 20ul第四步純化后�DNA至新EP管中,加�20ul上述待用C1 beads,充分混�,置于旋�(zhuǎn)混勻儀(Rotating Mixer) 旋轉(zhuǎn)孵育30min�

3. 取下�100g 離心10s,置于磁力架�,放�2.5 min,待溶液完全澄清后,棄去上清�

4. 加入1 mL溶液BW,重�C1 beads(注:動作盡可能輕揉),置于旋轉(zhuǎn)混勻儀(Rotating Mixer) 旋轉(zhuǎn)混勻3 min�

5. 取下�100g 離心10s,置于磁力架�,放�2.5 min,待溶液完全澄清�,棄去上清�

6. 重復(fù)步驟4,5三次�

7. 加入1 mL溶液TW,重�C1 beads(注:動作盡可能輕揉�,置于旋�(zhuǎn)混勻儀(Rotating Mixer) 旋轉(zhuǎn)混勻2min�

8. 取下�100g 離心10s,置于磁力架�,放�2.5 min,待溶液完全澄清�,棄去上清�

9. 重復(fù)步驟7�8一次�

10. 加入10ul新配�0.05mM 二硫蘇糖�DTT溶液,重�C1 beads(注:動作盡可能輕揉�,置�Thermo-mixer (Eppendorf)��37°C�750rmp反應(yīng)1h�

注:0.05mM 二硫蘇糖�DTT溶液需�(xiàn)配現(xiàn)�

20min取出再混勻一次,防止C1 beads沉底

11. 1h�,置于磁力架�,放�2min,待溶液完全澄清�,取上清至新EP管中,加20ul超純水稀��

12. 按照Bio-Spin® P-30 Gel Columns說明書純化上述溶液�

六.PCR富集

1. 按照NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB,#E7645)說明書進行PCR 反應(yīng)�

2. 按照AMPure XP Beads(Beckman Coulter, Inc. #A63881)說明書純化上�PCR�(chǎn)�,加�23 ul 超純�,洗脫至�EP管中,于-20°C保存�

【延伸拓展�

5-羥甲基胞嘧啶作為基因組上另一種含量更�、更重要的核酸修�,可以被氧化劑釕酸鉀特異性氧化成5-醛基胞嘧啶,而基因組上原有的5-醛基胞嘧啶可以被乙基羥胺特異性保�。將本試劑盒�5-羥甲基胞嘧啶的氧化和5-醛基胞嘧啶的保護�(jié)合起�,可以實�(xiàn)5-羥甲基胞嘧啶的全基因組單堿基分辨率檢測。釕酸鉀可通過購買高釕酸鉀(Aldrich, 334537)制備,乙基羥胺可直接購買(Aldrich, 274992)。具體操作可參照以下參考文獻:

Hu Z. et al. Bisulfite-Free, Nanoscale Analysis of 5Hydroxymethylcytosine at Single Base Resolution J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 13


 

�1� 總共1�